產品技術與常見問題解答
ELISPOT實驗常見問題
ELISA實驗操作注意事項
產品技術與常見問題解答
ELISPOT 實驗操作注意事項
ELISPOT 實驗操作注意事項

ELISA常見問題

 

1. ELISA操作前需做好哪些準備工作?

答:ELISA操作前,應做好實驗的設計、選擇適合自己檢測範圍和靈敏度的試劑盒、提前定購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。其中,樣本的處理非常關鍵。檢測樣本一般有血清、血漿、細胞培養上清液、尿液等。如血清的製備,應在凝血後盡可能快地分離血清。新鮮製備的樣本最好及時檢測,如果情況特殊需保存樣本,4可保存24小時,長期保存要-70以下分裝凍存。檢測前樣本必須澄清,可通過過濾或離心除去沉澱。凍存樣本融解後一定要混合均勻,避免反覆凍存樣本。

2.ELISA試劑盒的保存和回溫應注意哪些?

答:ELISA試劑盒的回溫對ELISA實驗很重要,需要試驗者引以為重。試劑盒使用前平衡室溫的意義在於ELISA實驗對溫度敏感。第一、回溫高濃度清洗液是為了在4℃保存的高濃度清洗液出現結晶,可以重新溶解。只有平衡至室溫,才能準確配置清洗液的濃度。第二、平衡稀釋液是為了ELISA實驗在室溫或37度培養的必須條件準確。若沒有平衡室溫,如某些步驟只培養1小時,甚至20分鐘,那麼ELISA實驗反應效率就由於反應溫度降低而大大降低,導致實驗O.D值讀數非常低。 第三、預包埋板條保存在真空乾燥的鋁箔袋中,使用前先於室溫回溫後再打開包裝的板條,就可以避免打開包裝後,外界的水氣凝結板條上,不利於剩餘板條的保存。這好比乾燥的麵包潮濕的水氣給污染了,保存時間就很短。 同樣,拆開包裝的板條要減少在外界暴露的時間,保留乾燥劑在袋中,用膠帶或帶封口的塑膠袋密閉封口,4℃保存,在2個月內使用。

3. ELISA的標準品如何操作?

答:標準品是試劑盒的檢測抗原的一個重要尺規,因此標準品的溶解、序列稀釋和保存要特別注意以下細節:標準品溶解按照說明書的要求,準確回溶。在冰上操作標準品為佳,靜止510分鐘,輕輕搖勻後按照一次量分裝,在-20度或-70度保存。標準品嚴禁反覆凍融。標準品的序列稀釋應事先做好準備,如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備;稀釋時,應充分混勻;採用進口或者矽化的EP管,減少蛋白吸附。在實驗孔內進行序列稀釋時,注意操作規範,Tip切勿刮劃預包板的盤底。

4. ELISA操作中的洗滌要注意哪些?

答:洗滌是ELISA實驗中是最多次數的操作,也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不乾淨或交叉污染現象,實驗重複效果差的現象。不管multipipette、洗瓶、吸管,還是ELISA Washer,嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現洗板不乾淨現象

a) 清洗液不要溢出孔外,以免污染相鄰的孔,特別是每次洗板的前兩遍,若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景值肯定會增高。

b) 特別注意:設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置,保證甩掉清洗液時,空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開最好。同時注意甩掉清洗液的動作翻轉(從正上方旋轉120150度)要迅速、乾脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉來甩液體!甩出後以直線方式補23次甩出剩餘液體。

c) 用乾淨的濾紙,不要用衛生紙,因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,導致洗板不乾淨,結果偏高或偏低,重複孔的數值也會相差很大。

d) 每次拍板不要重複在一個地方拍,特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,否則拍不乾淨,拍板很用力不會對蛋白有什麼影響。但注意不要太重,以至把多孔盤給拍斷。每次洗板後輕叩幾下,最後一次一定要扣乾淨。

e) 不能減少清洗液體積、洗板時間和次數。洗板時間太短,洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數可以使背景更乾淨。

ELISA的標準曲線如何製作?

答:一般情況按照說明書推薦方法製作標準曲線。標準曲線可以由ELISA Reader附帶軟體自動生成,也可手動製作。標準曲線,中間部分為較佳的檢測範圍。當標準品的量超過與抗體結合的量,此時標準品已飽和,再增加標準品的量,其OD值不再變化,故當標準品達到一定濃度後,曲線就趨於水平。一般廠商給出廠的濃度範圍落在中間線性範圍,根據標準曲線,可以測出樣本的濃度。

ELISA試驗出現非常弱的結果,應如何分析和查找原因?

答:ELISA試驗出現非常弱的結果,常見有7種原因,其解決方法如下:

1) 可能原因:溫育的時間或者溫度不夠;

解決方法:校正培養箱溫度。

2) 可能原因:呈色反應時間太短;

解決方法:校正定時鐘準確定時。

3) 可能原因:所用配製緩衝液的純水有問題;

解決方法:使用新鮮合格的純水。

4) 可能原因:加入抗體/酵素的稀釋液濃度太低;

解決方法:按照說明書保存試劑盒和準確配製工作液。校正移液器,,裝Tip時要緊密。

5) 可能原因:ELISA Reader濾光片不正確;

解決方法:檢查使用的濾光片。

6) 可能原因:試劑盒沒有充分平衡;

解決方法:試劑室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫。

7) 可能原因:不正確的試劑儲存方式;

解決方法:按照說明書要求保存試劑盒。

6. 試驗的標準曲線和測定的再現性差,這是什麼原因造成的?

答:試驗的標準曲線和測定的再現性差,這是典型的由測定操作引起的問題,常見原因如下:

a) 可能原因:加樣本及試劑量不準;孔間不一致;

解決方法:校正移液器,,裝Tip時要緊密。

重複某一樣品時,加樣時間盡可能與第一次接近;

重複測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;

樣品稀釋前應充分混勻。

b) 可能原因:加樣過快,孔間發生污染;

解決方法:重複測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。

c) 可能原因:加錯樣本;

解決方法:檢查記錄和試劑,是否加錯樣本。

d) 可能原因:加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包埋區;

解決方法:加樣時Tip頭不要貼壁。

e) 可能原因:不同批號試劑盒混合使用;

解決方法:不同批號試劑盒不可混合混用。

f) 可能原因:溫育時間、洗板、顯色時間不一致;

解決方法:檢查時間是否一致。

g) 可能原因:孔內污染雜物;

解決方法:離心樣品,排除雜物。

h) 可能原因:試劑/樣品沒有混勻;

解決方法:充分混勻樣品和試劑。

i) 可能原因:血清樣本未完全凝固即加入,反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血液細胞,易出現假陽性反應等。

解決方法:待血清樣本完全凝固後做試驗。

7. 試驗結果白板,而且陽性對照不呈色,應如何分析和查找原因?

答:試驗結果白板,而且陽性對照不呈色,常見原因如下:

a) 可能原因:漏加或者誤加試劑;

解決方法:檢查試驗記錄和剩餘試劑。每次加液前均應核對標籤。

b) 可能原因:試劑過期;

解決方法:使用有效期內的產品。

可能原因:洗板液配製中出現問題,如量筒不乾淨含HRP抑制物

解決方法:使用乾淨的器皿,正確配製試劑。

c) 可能原因:溫育的時間或溫度不夠;

解決方法:校正溫育箱溫度。

d) 可能原因:標準品失活;

解決方法:標準品正確保存、溶解和混勻。

e) 可能原因:抗體失活;

解決方法:更換抗體或者提高抗體濃度

f) 可能原因:酵素失活

檢查方法:把工作濃度的酵素再稀釋20100倍,取5uL加入50ul的呈色底物,終止後呈色是否能達到1.0左右,此為酵素的粗略估計。

解決方法:更換酵素或者提高酵素的濃度。

g) 可能原因:呈色底物失活

檢查方法:加少量的工作濃度的酵素,TMB是否很快顯色。
解決辦法:更換呈色底物.

8. 試驗結果空白背景高,這是什麼原因造成的?

答:試驗結果空白背景高,常見原因如下:

a) 可能原因:清洗不乾淨;

解決方法:充分洗滌,徹底拍幹;洗板要防止交叉污染;濃縮清洗液準確配製;Tip盡可能一次性使用;50倍濃縮洗滌液如有結晶則應讓結晶於室溫全部溶解後再量取稀釋;加樣或加酵素拍板的濾紙應棄去不用,不要反復使用,否則易造成污染。

b) 可能原因:呈色液變質或者試劑過期;

解決方法:檢查試劑盒有效期限。

c) 可能原因:試劑稀釋有誤,如加酵素的濃度過高;

解決方法:請按說明書所示稀釋倍數配製;

d) 可能原因:純水受污染;

解決方法:使用新鮮蒸餾水;

e) 可能原因:試劑混用;

解決方法:不同批號試劑請勿混用。

f) 可能原因:培養箱溫度超過37或反應時間過長。

解決方法:呈色反應時間適當縮短。

 
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