ELISPOT實驗常見問題

1.      提取周邊血液單核球細胞(PBMC)時,需要注意哪些事項?

答:如果取周邊血液單核球細胞(PBMC)進行ELISPOT檢測,建議採用新鮮血液。在保證無菌操作的條件下,首先應保證採血時抗凝劑應及時充分地與血液混勻,避免血凝塊的出現。抗凝血最好及時提取PBMC,避免放置時間過長,室溫下避免過夜。應選用分離效果好的淋巴細胞分離液,避免PBMC中混有過多的其他細胞成分或雜質。

 

2.      在分離周邊血液單核球細胞的時候,發生了溶血,會影響我的實驗結果嗎?

答:周邊血液出現溶血後,在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時,溶血產生的細胞碎片、血紅素等雜質將極大可能懸浮於分離液的層面,在吸取PBMC時容易混入這些雜質。由於混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除,在進行ELISPOT實驗時,有可能沉積在培養盤底,嚴重影響細胞因子和抗體的結合,進而影響實驗結果。

 

3.      採取什麼方法分離周邊血液淋巴細胞適合於ELISPOT實驗?

答:使用專業的淋巴細胞分離液(或分離管)。如: EZ-SepTM Human Lymphocyte separation tubeEZ-SepTM Mouse 1×(也可用來分離大鼠/兔子等外周血淋巴細胞)

 

4.      從動物脾臟組織分離淋巴細胞應如何操作?

答:取動物脾臟組織時,應注意無菌操作。分離出脾臟組織,研磨過200目篩網,保證所分離的細胞為單核細胞懸浮液。獲得細胞懸浮液後應該使用專業的淋巴細胞分離液進行分離單核細胞。

 

5.      ELISPOT板上,每孔應放多少數目的淋巴細胞?

答:在使用Con APHA等陽性刺激孔中,一般放置的淋巴細胞數目為104~2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下,每孔的細胞濃度可在1~4×105。在使用polyclone刺激劑的情況下,應適當調低細胞濃度。由於不同刺激劑刺激效果和刺激強度不同,建議客戶在初次進行ELISPOT檢測時,對刺激劑濃度和細胞濃度設立梯度,以保證較理想的實驗結果。

 

6.      對淋巴細胞進行體外刺激預先培養、板內同步刺激培養應如何操作?

答:將抗原和淋巴細胞在體外混合,刺激並預培養,是通用的方法。預培養的淋巴細胞,在置入ELISPOT板之前應使用回溫到37℃的培養液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以後,通常在37℃培養5-6小時。

    對於高度特異性抗原,可以採用將淋巴細胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中,在37℃培養箱中同步進行刺激、培養和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內同步刺激培養的時間通常為22-24小時。

 

7.      ELISPOT實驗中刺激物應如何選取?

答:常用的非特異性刺激物有PMA/ionomycinPHACon A等。根據具體的實驗選擇上稍有不同。一般而言,刺激小鼠細胞用PMA/ionomycin或者Con A,刺激人類PBMC多用PHA

特異性的刺激物主要有CEFICE(只用於人PBMC的刺激)等多肽或者蛋白。

 

8.      在使用抗原刺激淋巴細胞培養過程中,若發現培養液變黃,有什麼影響?

答:這種現象通常見於使用很強的Polyclone抗原刺激淋巴細胞。某些Polyclone抗原會導致淋巴細胞凋亡或者死亡,大量淋巴細胞死亡後會使培養液變黃。使用這些淋巴細胞進行後續ELISPOT實驗通常得到很低的斑點(SPOT)形成。換用特異性抗原後可以避免該現象。

 

9.      ELISPOT結果中出現:不規則的大塊斑點,有的區域沒有斑點是什麼原因?

答:不規則斑點區域的出現一般是細胞分離不完全所致。有時候採用Polyclone抗原培養的淋巴細胞也會產生成團現象。請確認加入到ELISPOT板中進行培養的細胞是單細胞懸浮液。

 

10.  如何選擇合適的培養基?

答:推薦使用無血清培養基(注意:是指專業的完全培養基,不是不含血清的1640等基本培養基)。如本公司LymphoSpotTM無血清培養基、進口的荷蘭U-Cytech公司生產的LymphoSpotTM serum free medium等。也可以根據實際情況選用自備的1640培養基(含5-10%血清)。

 
檔案下載
檔案名稱 檔案敘述 建檔日期 檔案下載
ELISPOT實驗常見問題 ELISPOT實驗常見問題 2011-04-07
== Don't remove this. == -- == Don't remove this. == 0||